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『銳翌成果展』小柳原田綜合征(VKH)患者腸道微生物組成的改變

2020年1月13日,銳翌基因與重慶醫科大學附屬第一醫院在《GUT MICROBES》上合作發表研究成果《Altered gut microbiome composition in patients with Vogt-Koyanagi-Harada disease》,銳翌生物創始人秦楠博士為文章共同通訊作者

 

導讀

小柳原田綜合征(Vogt-Koyanagi-Harada,VKH)是一種以雙眼肉芽腫性全葡萄膜炎為特征的多系統自身免疫性疾病。腸道菌群一直被認為在該病的發病過程中起著重要作用,但腸道菌群的改變是否參與了該病的發病過程尚不清楚。為研究VKH疾病中腸道微生物組成的特征,本研究通過宏基因組測序技術,分析了VKH患者腸道菌群的物種圖譜和代謝途徑,構建了有助于疾病診斷和預后的微生物相關標記基因集;通過糞菌移植(FMT)實驗,發現VKH患者腸道菌群顯著加重了實驗性葡萄膜炎動物模型的眼部炎癥。

 

文獻ID

題目:Altered gut microbiome composition in patients with Vogt-Koyanagi-Harada disease

譯名:小柳原田綜合征(VKH)患者腸道微生物組成的改變

發表期刊:《GUT MICROBES》  IF:7.823

發表時間:2020年1月13日

第一作者:葉子、吳春燕

通訊作者:楊培增、秦楠

 

實驗設計及技術路線

本研究共納入149名個體(71例未接受治療的活動期VKH患者,11例接受系統性皮質類固醇聯合其他免疫抑制劑治療的非活動期VKH患者,67例健康對照)。診斷VKH疾病嚴格按照國際命名委員會修訂的VKH疾病診斷標準。

 

排除標準:患有其他疾病如糖尿病、心血管疾病和傳染病,以及在研究后一個月內服用抗生素或益生菌的患者被排除在外。

 

研究成果

1、VKH患者腸道菌群失調

活動期VKH患者與健康對照組腸道菌群的α多樣性(Shannon index,observed species,P>0.05)和β多樣性(Bray-Curtis 距離度量;ANOSIM,P>0.05)沒有顯著性差異(P>0.05)。但兩組間微生物組成存在明顯不同。在屬水平上,VKH患者的Ramularia(柱隔孢屬)、Alternaria(鏈格孢屬)和Rhizophagus豐度增加,而Methanoculleus(甲烷囊菌屬)、Candidatus MethanomethylophilusAzospirillum(固氮螺菌屬)則減少(圖1a)。柱隔孢屬的R. collo-cygni和鏈格孢屬的A. alternata被確定為VKH富集的物種,兩個梭菌 (Clostridium sp. CAG:813Clostridium sp. CAG:349),甲烷囊菌屬的Methanoculleus sp. CAG:1088Candidatus Methanomethylophilus屬的Candidatus Methanomethylophilus alvus和固氮螺菌屬的Azospirillum sp. CAG:260被確定為VKH減少的物種(圖1b)。

 

LEfSe分析進一步驗證了活動期VKH患者和健康對照組之間的不同微生物特征,并顯示出類似的結果。尤其是,Paraprevotella spp.Paraprevotella clara CAG116Paraprevotella_clara)在活動期VKH患者中富集,而梭菌屬(Clostridium sp. CAG:349Clostridium sp. CAG:813),雙歧桿菌屬(Bifidobacterium sp. MSTE12Bifidobacterium dentium),Candidatus Methanomethylophilus alvusMethanoculleus sp. CAG:1088減少(圖1c)。 

 

圖1 VKH與健康對照組之間的差異物種

 

2、VKH患者不同腸型腸道菌群失調

為了研究VKH患者腸道菌群的失調是否也存在于腸型亞群中,研究確定了VKH患者和健康對照組中豐度最高的前20個屬。根據屬的相對豐度,通過層次聚類分析,確定VKH患者和健康對照組的三種腸型。Cluster 1的特征是混合的菌屬,包括Bacteroides(擬桿菌屬), Prevotella(普氏菌屬),AlisipesParabacteroides。Cluster 2是高豐度的擬桿菌屬和低豐度的普氏桿菌屬。Cluster 3的特征是普氏桿菌相對豐度高,而擬桿菌的豐度低。結果表明,VKH患者于對照組的三種腸型分布無顯著差異(P=0.34)。

 

通過LEfSe分析,確定VKH患者和對照組之間三種腸型的微生物組成差異。所有VKH患者中都鑒定到的VKH減少的物種,包括梭菌屬(Clostridium sp. CAG:349Clostridium sp. CAG:813),雙歧桿菌屬(Bifidobacterium sp. MSTE12Bifidobacterium dentium),Candidatus Methanomethylophilus alvusMethanoculleus sp. CAG:1088在Cluster 1混合腸型(Mix enterotype)的患者中豐度也減少。Cluster 2擬桿菌腸型中,在活動期VKH患者中確定了一個富集菌屬Paracteroides sp. CAG2和減少的Alistipes屬 (Alistipes sp. AL.1Alistipes sp. 400CAG:29),Proteobacteria bacterium CAG:495Eubacterium sp. CAG:115Roseburia sp.CAG:380,這與所有患者的LEfSe分析結果一致。在Cluster 3,普氏菌腸型VKH患者中,有部分Parabacteroides spp.Parabacteroides 405 sp.2.1.7Parabacteroides sp.D25),擬桿菌屬(Bacteroides coprocola CAG:162Bacteroides thetaiotaomicron CAG:40)富集(圖2)。

 

圖2 3種腸型中,VKH患者和健康對照組物種LEfSe差異分析

 

3、VKH患者腸道菌群功能障礙

為研究腸道微生物在VKH疾病中的功能作用,我們構建了來自VKH患者和健康對照組1718179個非冗余基因的基因集,并使用KEGG和eggNOG進行功能注釋。LEfSe分析顯示,活動期VKH患者與健康對照組之間有6個KEGG orthologues (KO)和6個eggNOG orthologues (OG)存在顯著差異。在代謝途徑水平上,VKH活動期患者中富集了10條代謝途徑,包括氧化磷酸化(ko00190)和脂多糖生物合成(ko00540)。此外,在VKH活動期患者中,有54個模塊包括脂多糖生物合成(M00060)、VI型分泌系統(M00334)、乙酰輔酶A還原途徑(M00377) 更為豐富(圖3)。

 

圖3 VKH和健康對照組以及治療前后患者KO模塊

 

4、VKH患者腸道微生物組成的改變與HLA-DRA有關

我們之前的研究確定了VKH疾病的三個易感基因位點,包括IL-23R-C1orf141、ADO-ZNF365-EGR2和HLA-DRA/HLA-DRB1。為研究這些易感基因型與腸道菌群組成之間是否存在相關性,我們根據這三個易感位點的6個主要SNP對54例VKH患者進行基因分型。將VKH患者分為具有和不具有風險等位基因的兩組。LEfSe分析比較兩組間的微生物組成。結果表明,HLA-DRA風險等位基因與2個VKH富集物種(Bacteroides sp.2.1.33BParaprevotella clara)呈正相關,與2個VKH減少物種(Alistipes finegoldiiEubacterium eligens)呈負相關。沒有觀察到腸道微生物組成與IL-23R-C1orf141、HLA-DRB1或ADO-ZNF365-EGR2之間的相關性。

 

5、免疫抑制治療部分改變了VKH患者的腸道菌群

免疫抑制劑用于治療VKH疾病,并已被證明能有效控制眼部炎癥。采用LEfSe分析方法,探討免疫抑制治療對11例VKH患者在接受系統糖皮質激素聯合環孢素A治療前后腸道微生物組成的影響。結果表明,與治療前相比,治療后9個屬和27個種富集,15個種減少。在這些差異特征中,VKH富集的物種,嗜酸鏈球菌Acidaminococcus sp.BV3L6在治療后顯著降低,而3種VKH減少菌,變形桿菌Proteobacteria bacterium CAG495、固氮螺菌屬Azospirillum sp.CAG260Alistipes sp.CAG435顯著升高。進一步分析治療后微生物組功能的改變。與治療前相比,VKH患者治療后36個模塊富集,35個模塊減少。在這些患者治療前后出現顯著差異的模塊中,3個VKH減少模塊增加,2個VKH富集模塊減少(圖3)。總之,對治療的響應反映了菌群與VKH的聯系。

 

為檢驗腸道菌群是否與治療反應相關,結合50例VKH患者治療后的臨床資料,然后比較了非活動期眼部炎癥患者(30例)和治療后復發性眼部炎癥患者(20例)的腸道菌群。LEfSe分析發現這兩組中有70個物種存在差異。其中,5個Alistipes sp.Bacteroides sp. UW對治療反應良好(圖5a)。

 

6、VKH疾病腸道微生物標記譜的建立

為了建立VKH疾病腸道微生物組的標記譜,使用了包括55名VKH患者和52名健康對照者的訓練集構建SVM分類器,該分類器包含40個物種。AUC曲線下面積為89.16%,95% CI為83.37%-94.95%(圖4b)。該分類器也在16例VKH患者和15例對照組中進行了驗證。結果顯示AUC值為83.75% (95% CI: 69.74%-97.76%),表明這些標記物在鑒別VKH患者與健康對照組中的有效性(圖4c)。

 

另一種基于37種炎癥預后相關物種的標記微生物SVM分類器(圖5b)。結果表明,該分類器能夠區分預后良好的患者與復發的患者(AUC = 93.65%,95% CI = 86.87%-100%)(圖5c)。

 

圖4 用于區分VKH患者與健康對照組的分類器

 

圖5 用來預測預后的物種

 

7、VKH患者腸道菌群移植加重實驗性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)

為研究VKH患者的腸道微生物組成是否有助于該病的發展,研究檢測了糞菌移植(FMT)對EAU病程的影響(EAU是一種包括VKH疾病在內的、與人類葡萄膜炎有許多相似特征的動物模型)。我們首先對來自抗生素處理的小鼠糞便樣本和人糞便定植小鼠的糞便樣本進行了16S rRNA基因序列分析。Shannon多樣性指數(圖6a)和PCoA 分析(圖6b)顯示,經抗生素處理的小鼠微生物多樣性極低,人糞便定植小鼠的腸道微生物表型與經抗生素處理的小鼠完全不同。此外,與糞菌移植健康受體小鼠相比,VKH減少菌屬Alistipes在VKH受體小鼠中也減少。

 

VKH受體組成功誘導出EAU后,視網膜蛋白肽IRBP161-180與弗氏佐劑(CFA)完全免疫結合,臨床表現包括結膜充血、睫狀充血、角膜水腫、虹膜后粘連、前房閃輝和細胞(臨床評分:3.5 ~ 5)(圖6c)。對照組(臨床評分:0 ~ 1.5)和PBS處理組(臨床評分:0 ~ 0.5)中有1例輕微葡萄膜炎伴有結膜充血(臨床評分:0 ~ 1.5)(圖6e)。組織學分析還顯示,VKH受體組眼部有顯著病理改變,表現為視網膜結構紊亂,如嚴重的視網膜折疊和剝離,視網膜及脈絡膜上大量炎性細胞滲出,以及視網膜血管炎(組織學評分:2到4)(圖6d)。然而,對照組(圖6f)和PBS處理組(圖6h)沒有或很少觀察到視網膜結構的異常(組織學得分:0到1)。我們的臨床和組織學結果顯示,VKH受體組的得分顯著高于對照組以及PBS處理組(圖6j)。

 

圖6 應用VKH患者菌群FMT對EAU的影響

 

研究結論

1、在活動期VKH患者(包括混合腸型和擬桿菌腸型VKH患者)中,均發現了產丁酸鹽細菌、產乳酸細菌和產甲烷菌,以及豐富的革蘭氏陰性細菌。免疫抑制治療后VKH患者腸道菌群部分恢復。

2、HLA-DRA易感基因型與Bacteroides sp.2.1.33BParaprevotella claraAlistipes finegoldiiEubacterium eligens有關。

3、建立了包括40種疾病相關物種的微生物標記譜,以區分患者和對照組。另一種微生物標記譜包括37種與治療反應相關的物種。

4、VKH患者腸道菌群的移植可顯著加劇實驗性葡萄膜炎動物模型的疾病特征。

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